近年來，抗生素被廣泛應用于醫療和畜牧業，根據2000年—2018年的研究，全球抗生素消耗量增長了46%，其中青霉素類、磺胺類和喹諾酮類等抗生素主要在發展中國家被廣泛使用，2000年—2010年的使用量增長了36%。抗生素的濫用導致細菌產生耐藥性，加劇了抗性基因（ARGs）在生態環境中的傳播，對公眾健康構成威脅。硝化污泥系統可以通過氨氧化微生物的共代謝作用有效去除多種藥理活性化合物（PhACs），包括抗生素、雌激素、阿替洛爾等。氨氧化微生物以氨氧化細菌（AOB）為主，其分泌的一種非特異性酶（氨單加氧酶），可以將氨氧化成羥胺的同時有效降解抗生素。但是抗生素廢水的條件經常發生波動，比如鹽度、pH、溫度等，而硝化污泥系統對抗生素的降解效果易受到這些因素的影響，進而影響ARGs的豐度。目前，在硝化污泥系統去除抗生素的過程中，關于鹽度對ARGs影響的研究較少。為此，筆者以一種廣泛使用的磺胺類抗生素磺胺嘧啶（SDZ）為研究對象，探究鹽度對硝化污泥系統去除抗生素效能的影響，并分析不同鹽度下系統中ARGs豐度以及微生物群落結構的變化。

1、材料與方法

1.1 試驗材料

試驗接種污泥取自濟南光大水務小清河污水處理廠二沉池中的回流污泥。試驗進水采用模擬廢水，SDZ濃度為5.0mg/L，其他組分如下：氯化銨為191mg/L、磷酸氫二鉀為58mg/L、磷酸二氫鉀為24mg/L、二水合氯化鈣為67mg/L、結晶硫酸鎂為42mg/L、碳酸氫鈉為1000mg/L。廢水中加入微量元素溶液，以保證微生物正常生長，其組分如下：氯化鐵為1500mg/L、硼酸為150mg/L、五水合硫酸銅為30mg/L、碘化鉀為30mg/L、四水合氯化錳為120mg/L、二水合鉬酸鈉為60mg/L、七水合硫酸鋅為120mg/L、六水合氯化鈷為150mg/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 污泥馴化

由于接種污泥中硝化細菌的含量和活性均較低，因此，試驗開始時需要對其進行馴化，馴化總周期為30d。試驗裝置如圖1所示，采用圓柱形SBR反應器，有效容積為4L，體積交換比為1∶1。反應器為全自動運行，每個運行周期為6h，其中進水30min、曝氣270min、污泥沉降30min、出水10min、靜置20min，每天運行4個周期。

試驗采用好氧曝氣，并采取連續增加進水負荷的方法來馴化污泥，最終使得進水氨氮濃度控制在50mg/L。馴化過程中需要對反應器進行定期排泥，以保證污泥濃度基本維持在4000mg/L。當系統出水水質穩定、NH4+-N基本被完全去除且無NO2--N積累時，表明硝化污泥馴化完成。

1.2.2 硝化污泥系統性能研究

試驗設置4組平行的SBR反應器（S1~S4），將馴化完成后的污泥放至反應器中，并控制每個反應器的污泥濃度在4000mg/L左右。反應器的運行參數與污泥馴化階段一致。通過控制NaCl的添加量使反應器S1~S4的進水鹽度分別為0、0.5%、1.0%、2.0%，反應器運行30d，分別在第1、5、10、15、20、25、30天測定出水NH4+-N、NO3--N、NO2--N以及SDZ濃度，考察不同鹽度下系統的硝化效果以及對SDZ的去除效果。其中，NH4+-N、NO3--N、NO2--N濃度均采用國家標準方法進行測定，SDZ濃度采用高效液相色譜儀進行測定。

1.2.3 amoA、ARGs和微生物群落分析

已有研究證實，在氨存在的情況下，AOB的共代謝降解是去除SDZ的主要機制，亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的貢獻很小。amoA基因的表達量可以作為AOB活性的生物標志物，水平基因轉移（HGT）和微生物群落是影響ARGs豐度的兩個重要因素，因此在試驗運行30d后提取不同鹽度反應器的污泥樣本DNA進行q-PCR檢測，探究每個階段污泥中amoA基因、整合子基因（intI1，水平轉移的指示性基因）、ARGs（sul1、sul2）和細菌的16SrRNA基因豐度的變化情況，并分析不同鹽度條件下硝化污泥系統中微生物群落結構的變化。同時對ARGs、intI1和微生物群落豐度進行了Pearson相關性分析，確定ARGs豐度的變化機制。其中宿主菌的識別依據是相關性的顯著性系數（p值），當p<0.05時為顯著相關，即認為該菌是ARGs的宿主菌。相關性分析由SPSS軟件完成，微生物群落與ARGs的相關性熱圖由Origin軟件完成。

2、結果與討論

2.1 SDZ的去除

不同鹽度條件下硝化污泥系統對SDZ的去除效果如圖2所示。在無鹽度條件下，在生物降解的最初10d，反應器對SDZ的去除率呈升高趨勢，并在第10天達到最佳去除效果，而后趨于穩定（平均去除率為93.37%），這種現象與硝化污泥對抗生素的適應性有關。隨著進水鹽度的增加，硝化污泥系統對SDZ的去除率逐漸降低。當進水鹽度分別為0.5%、1.0%和2.0%時，第10天時對SDZ的去除率分別為94.3%、71.2%和42.3%。此外，鹽度由0.5%增加到2.0%時，出水SDZ濃度由0.276mg/L增加到2.804mg/L。該結果表明，長期暴露在鹽度沖擊負荷環境下，硝化污泥對抗生素的生物降解能力受到影響，降解能力隨著鹽度的增加而逐漸降低，這也說明在高鹽度下微生物活性較低。

2.2 鹽度對硝化污泥系統性能的影響

不同鹽度下硝化污泥系統的性能如圖3所示。

在未添加NaCl的反應器S1中，NH4+-N能夠被快速去除，平均去除率可達99%。當鹽度由0.5%增加到1.0%時，NH4+-N的平均去除率稍微降低（由98.97%降至82.06%），而當鹽度增加到2.0%時，NH4+-N的平均去除率急劇下降，僅為54.88%。該結果表明高鹽度對反應器的硝化性能有顯著影響，這是由于AOB對鹽度敏感，在高鹽環境中生長緩慢，氨氧化活性被抑制，從而導致NH4+-N去除率降低。

在未添加NaCl的反應器S1中，大部分NH4+-N轉化為NO3--N（平均濃度為48.63mg/L），幾乎沒有出現NO2--N的積累，說明系統硝化性能良好。而當進水鹽度為1.0%和2.0%時，NO2--N濃度有所升高，NO3--N濃度降低，尤其是當鹽度為2.0%時，NO2--N平均濃度增至3.63mg/L，而NO3--N平均濃度僅為26.09mg/L，這是由于在此鹽度下AOB和NOB活性均受到一定程度的抑制。綜上所述，在較低鹽度（0.5%）條件下硝化污泥系統的硝化性能較好，但是當鹽度升高時（1.0%和2.0%），系統的硝化性能會受到不同程度的抑制。

2.3 鹽度對硝化污泥系統中微生物群落的影響

2.3.1 amoA基因的相對表達

amoA基因的表達受到了鹽度沖擊的影響。amoA基因的豐度在未投加NaCl的初始污泥中最高，為6.45×10-6copies（以16SrRNA為標準，下同）。投加NaCl之后，amoA基因的豐度隨著鹽度的增加而逐漸降低，當鹽度增至2.0%時其豐度最低，為2.42×10-6copies。這表明鹽度對硝化污泥系統中amoA基因的表達具有顯著的抑制作用，鹽度沖擊負荷越大，系統內AOB活性受到的抑制作用也越大，這與高鹽度下NH4+-N去除率下降的結果一致。

2.3.2 屬水平上的菌群變化

運行30d后，不同鹽度下硝化污泥系統中微生物菌群在屬水平上的分布情況如圖4所示。

從圖4可以看出，隨著進水鹽度的增加，相對豐度排名前30之外的其他菌種豐度逐漸升高，說明鹽度的沖擊降低了物種分布的均勻程度。在硝化污泥系統中，AOB和異養菌均參與抗生素的去除過程。Nitrospiraceae作為常見的AOB，它所分泌的氨單加氧酶可以共代謝降解多種抗生素。圖4顯示，unidentified_Nitrospiraceae的相對豐度隨鹽度的升高而逐漸降低，這與amoA基因的表達變化一致。除了AOB，多種異養菌也被檢測到，如動膠菌屬（Zoogloea）、氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）和陶厄氏菌屬（Thauera）等。其中，Zoogloea、Hydrogenophaga均具有降解有機物和有毒物質的能力，Thauera具有降解芳香族污染物的能力，因此它們對磺胺嘧啶也具有一定的生物降解作用。另外發現，Zoogloea、Hydrogenophaga和Thauera的相對豐度在鹽度為2.0%時大幅降低，這是由于高鹽度會顯著影響細菌的細胞結構和生理功能，并在一定程度上抑制其活性。綜上，高鹽度抑制了抗生素降解菌的活性，進而導致抗生素去除率降低。

2.4 鹽度沖擊下ARGs的變化

在硝化污泥系統中，ARGs的傳播機制仍不明確，鹽度對ARGs的影響也有待研究。因此，本研究通過4個SBR反應器研究了不同鹽度條件下ARGs的豐度，結果如圖5所示。添加NaCl后，sul1和sul2的豐度隨著鹽度的提高而逐漸降低，但均比無鹽度條件下要高，其中，當鹽度為0.5%時，各基因的豐度均達到最大值，sul1和sul2的豐度分別為3.79×10-4、2.97×10-4copies，這表明低鹽度的沖擊促進了ARGs的增殖。

為了進一步確定ARGs的變化機制，對intI1、sul1和sul2進行相關性分析，結果顯示，sul1、sul2與intI1基因顯著相關，表明水平基因轉移促進了ARGs的傳播。另外，對微生物群落和sul1、sul2進行了相關性分析，結果如圖6所示（“*”表示在p<0.05水平上相關性顯著）。可知，Plasticicumulans、Sulfuritalea和Brevumdimonas是sul1和sul2的宿主菌。因此，水平轉移和微生物群落結構變化均會導致ARGs的變化，即0.5%鹽度條件下較高的sul1、sul2豐度一方面是由水平基因轉移（較高的intI1豐度）導致；另一方面，Plasticicumulans、Sulfuritalea以及Brevumdimonas在0.5%鹽度下較高的豐度也使得sul1和sul2豐度升高。

3、結論

①無鹽度時硝化污泥能夠高效去除SDZ，平均去除率可達93.37%，而高鹽度會抑制抗生素降解菌的活性，進而導致抗生素去除率降低。

②較低鹽度（0.5%）時硝化污泥系統的脫氮性能較好，NH4+-N去除率高達99%。但是當鹽度升高（1.0%和2.0%）時，AOB和NOB活性受到抑制，系統的硝化效果降低。

③NaCl的投加促進了ARGs的增殖，在較低鹽度（0.5%）時ARGs豐度最高，這是水平基因轉移和微生物群落變化共同作用的結果。