20世紀(jì)90年代，厭氧氨氧化（Anammox）技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它能夠在嚴(yán)格厭氧環(huán)境下，將NH4+-N和NO2--N轉(zhuǎn)化為氮?dú)夂蚇O3--N，與其他生物脫氮技術(shù)一起構(gòu)成了全球氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相較于傳統(tǒng)的硝化-反硝化過(guò)程，厭氧氨氧化以其突出的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，被視為最具成本效益的脫氮解決方案。

盡管厭氧氨氧化工藝已在城市污水處理廠(chǎng)的側(cè)流處理中得到有效驗(yàn)證，但科研人員仍在積極探索其在低濃度主流污水處理中的應(yīng)用潛力。然而，主流厭氧氨氧化工藝在實(shí)際操作中遭遇的挑戰(zhàn)比側(cè)流更為嚴(yán)峻，其首要問(wèn)題在于城市污水中的氨氮濃度普遍偏低，通常在20~60mg/L之間。底物的不足會(huì)抑制氨氧化菌（AOB）和厭氧氨氧化菌（AnAOB）的活性，同時(shí)，游離氨（FA）和游離亞硝酸（FNA）濃度的降低使得亞硝酸鹽氧化菌（NOB）的活性更難以被抑制，進(jìn)而導(dǎo)致出水中的硝態(tài)氮濃度超標(biāo)。科研人員正致力于突破這些限制，以提升厭氧氨氧化工藝在主流污水處理中的適應(yīng)能力。近期的多項(xiàng)研究揭示，采用多種生物量保留策略（如顆粒化、載體生物膜、凝膠包埋和膜技術(shù)）可以顯著提高厭氧氨氧化菌對(duì)主流環(huán)境的適應(yīng)能力。此外，具有高比厭氧氨氧化活性（SAA）的AnAOB展現(xiàn)出對(duì)多種極端環(huán)境條件（如低NH4+-N濃度、溫度波動(dòng)、C/N變化）的卓越適應(yīng)力，因而通過(guò)生物保留策略保留高SAA的AnAOB是實(shí)現(xiàn)主流厭氧氨氧化工藝應(yīng)用的關(guān)鍵。

為了利用生物膜保留策略來(lái)提升主流厭氧氨氧化活性，分別采用聚氨酯和生物炭作為載體進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。其中，聚氨酯由于其價(jià)廉及容易掛膜的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用；生物炭則作為一種富碳生物材料，因其原料來(lái)源廣泛、可以再生且成本低廉而受到學(xué)術(shù)界和工程領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。分別構(gòu)建了以聚氨酯和生物炭為載體的兩個(gè)厭氧氨氧化固定膜活性污泥反應(yīng)器（IFAS），通過(guò)測(cè)定微生物活性，并結(jié)合高通量測(cè)序和同位素示蹤法等手段，對(duì)活性污泥和生物膜上的功能微生物進(jìn)行了分析，以期為投加有機(jī)物條件下主流厭氧氨氧化工藝的有效強(qiáng)化提供參考。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及流程

試驗(yàn)裝置如圖1所示，采用集成固定膜活性污泥-上流式厭氧污泥床反應(yīng)器（IFAS-UASB），其有效容積為3.1L。進(jìn)水桶中的模擬污水通過(guò)氮?dú)馄科貧庵羺捬鯛顟B(tài)（DO<0.1mg/L）后密封，隨后通過(guò)蠕動(dòng)泵實(shí)現(xiàn)連續(xù)進(jìn)水，同時(shí)循環(huán)泵以1500%流量比循環(huán)反應(yīng)器內(nèi)部水流，為反應(yīng)器提供混合動(dòng)力。反應(yīng)器外層包裹黑色塑料膜以實(shí)現(xiàn)避光，同時(shí)其結(jié)構(gòu)包含1cm厚的水浴夾層。夾層內(nèi)的熱水通過(guò)潛水泵從底部進(jìn)水口泵入，隨后從上端出水口溢流至熱水桶中循環(huán)加熱。熱水桶通過(guò)電熱棒維持水溫在35℃，確保反應(yīng)器內(nèi)水溫穩(wěn)定在（33±1）℃。試驗(yàn)設(shè)置了兩組平行反應(yīng)器，分別填充聚氨酯海綿（R1反應(yīng)器）和核桃殼生物炭（R2反應(yīng)器），填料以懸掛方式固定于反應(yīng)器內(nèi)，填充體積占比為20%。

1.2 接種污泥及試驗(yàn)配水

接種污泥來(lái)源于武漢市某污水處理廠(chǎng)的二沉池污泥（MLSS為3500mg/L）以及某環(huán)保公司提供的成熟厭氧氨氧化菌（呈紅色，顆粒化良好），兩者按10∶1的體積比混合后用于系統(tǒng)啟動(dòng)。

試驗(yàn)采用人工配制的模擬污水，其N(xiāo)H4+-N為50mg/L，NO2--N為60mg/L，KH2PO4為30mg/L，CaCl2·2H2O為150mg/L，MgSO4·7H2O為300mg/L，KHCO3為1250mg/L，CH3COONa為25.65mg/L（COD=20mg/L），F(xiàn)eSO4為6.25mg/L，EDTA為6.25mg/L。每升配水中添加1mL微量元素溶液，其組成如下：H3BO4為14mg/L，NiCl2·6H2O為190mg/L，MnCl2·4H2O為990mg/L，Na2SeO4·10H2O為210mg/L，CuSO4·5H2O為250mg/L，Na2MoO4·2H2O為220mg/L，ZnSO4·7H2O為430mg/L，Na2WO4·2H2O為50mg/L。所有試驗(yàn)組的微量元素種類(lèi)和濃度均保持一致。為啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器，試驗(yàn)開(kāi)始前在不投加CH3COONa的情況下進(jìn)行了兩個(gè)月的厭氧污泥馴化。馴化成功后，在配水中添加CH3COONa以研究有機(jī)物濃度對(duì)反應(yīng)器脫氮性能的影響。

1.3 常規(guī)指標(biāo)分析方法

NH4+-N：納氏試劑分光光度法，NO3--N：紫外分光光度法，NO2--N：N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法，COD：重鉻酸鉀回流滴定法，MLSS：重量法，MLVSS：高溫灼燒法。

1.4 胞外聚合物的提取與測(cè)定

通過(guò)熱提取技術(shù)對(duì)污泥中的胞外聚合物（EPS）進(jìn)行分級(jí)提取，分別測(cè)定溶解性EPS（S-EPS）、松散結(jié)合型EPS（LB-EPS）以及緊密結(jié)合型EPS（TBEPS）含量。針對(duì)提取的各EPS組分，采用Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)（PN）含量，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖（PS）含量，并將兩者之和作為EPS總量。通過(guò)與MLVSS濃度進(jìn)行對(duì)比，可計(jì)算出厭氧氨氧化污泥中EPS的單位質(zhì)量濃度。

采用三維熒光光譜技術(shù)（3D-EEM）對(duì)EPS組分進(jìn)行表征。使用英國(guó)愛(ài)丁堡公司生產(chǎn)的FS5型熒光分光光度計(jì)對(duì)EPS提取物進(jìn)行檢測(cè)，其中激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)間隔均為5nm，掃描速度為12000nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5nm。通過(guò)Origin2018軟件對(duì)采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制等高線(xiàn)圖以呈現(xiàn)EEM光譜特征。

1.5 污泥的掃描電鏡圖像采集

在試驗(yàn)最終階段，從反應(yīng)器采集活性污泥及生物膜樣品，經(jīng)戊二醛固定液固定及乙醇逐級(jí)脫水后置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干，以備后續(xù)分析。完成上述預(yù)處理步驟后，利用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)污泥的微觀(guān)形貌進(jìn)行觀(guān)察。

1.6 微生物高通量測(cè)序

采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)污泥及生物膜樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析。試驗(yàn)前期和末期采集的樣本均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司基于IlluminaMiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，選擇通用PCR引物338F和806R對(duì)V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。所有測(cè)序數(shù)據(jù)的采集與后續(xù)分析均嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)流程，并在美吉云平臺(tái)上完成。

1.7 微生物酶活分析

為了研究投加有機(jī)物對(duì)IFAS中微生物活性的影響，在反應(yīng)器運(yùn)行的不同階段對(duì)微生物酶活性及電子傳遞系數(shù)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，取樣時(shí)間點(diǎn)與EPS取樣保持一致。

采用商品化酶活性檢測(cè)試劑盒（氨單加氧酶AMO、一氧化氮合酶NOS、聯(lián)氨氧化酶HZO）測(cè)定樣本酶活：取10μL樣品與40μL稀釋液加入酶標(biāo)板，37℃孵育60min后洗滌；依次加入底物H2O2/四甲基聯(lián)苯胺（TMB）避光顯色15min，終止反應(yīng)后于450nm下測(cè)定吸光度值（OD）。

電子傳遞系統(tǒng)（ETS）活性通過(guò)碘硝基四唑氯化物（INT）活性測(cè)試法進(jìn)行分光光度測(cè)定，而脫氫酶（DHA）活性則采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）脫氫酶活性測(cè)試法進(jìn)行測(cè)定。

1.8 15N穩(wěn)定同位素示蹤

采用15N同位素示蹤技術(shù)探究厭氧氨氧化系統(tǒng)脫氮途徑。取反應(yīng)器混合液，接種污泥并預(yù)培養(yǎng)24h（35℃，200r/min）以去除殘留氧及NOx-。設(shè)置兩組試驗(yàn)：①添加15NH4+監(jiān)測(cè)NOx-消耗；②添加14NH4+和15NO2-區(qū)分反硝化與厭氧氨氧化貢獻(xiàn)。反應(yīng)8h后以ZnCl2終止反應(yīng)，利用同位素質(zhì)譜儀測(cè)定29N2和30N2生成量，每組設(shè)三個(gè)平行。

2、結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)物對(duì)脫氮性能的影響

在進(jìn)水NH4+-N和NO2--N濃度分別為50mg/L和60mg/L的條件下，反應(yīng)器脫氮性能隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖2。試驗(yàn)持續(xù)了63d，其中R1反應(yīng)器表現(xiàn)出穩(wěn)定的運(yùn)行狀態(tài)，而R2反應(yīng)器的TN去除率在第38天出現(xiàn)了顯著降低，這可能與微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化有關(guān)。為提高R2反應(yīng)器的污染物去除效率，采取了兩種策略：首先，在第38~43天停止向R2反應(yīng)器中投加有機(jī)物，但脫氮效率并未立即回升，這與先前研究中關(guān)于在厭氧氨氧化系統(tǒng)中有機(jī)物抑制可逆的結(jié)論不符。隨后，在第44~51天將進(jìn)水氮濃度提高了一倍，同時(shí)提高水力停留時(shí)間（HRT）以保證氮負(fù)荷基本不變，在TN去除率恢復(fù)至試驗(yàn)前期約80%后，降低進(jìn)水氮濃度至初始值。

在試驗(yàn)過(guò)程中，R1反應(yīng)器表現(xiàn)出優(yōu)異的脫氮性能，NH4+-N和NO2--N平均去除率分別為90.70%和91.07%，TN去除率提升至69.88%。這表明，投加20mg/L的有機(jī)物顯著增強(qiáng)了R1反應(yīng)器的脫氮效能。R1反應(yīng)器在整個(gè)有機(jī)物投加階段均未出現(xiàn)去除率下降的現(xiàn)象，這可能得益于其聚氨酯填料表面形成的致密生物膜為功能微生物提供了生存空間。

在R2反應(yīng)器受損前（第1~34天）其脫氮性能良好，NH4+-N和NO2--N的平均去除率分別達(dá)到82.94%和87.03%，TN去除率提升至67.61%。然而，在受損期間（第35~37天），R2反應(yīng)器的脫氮性能明顯下降，TN去除率降至55.16%。在停止投加有機(jī)物階段，R2反應(yīng)器的脫氮性能并未恢復(fù)，損傷呈現(xiàn)不可逆性，同時(shí)反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落結(jié)構(gòu)傾向不穩(wěn)定。但是在將R2反應(yīng)器的進(jìn)水氮濃度提高了1倍后，TN去除率提高至64.09%，經(jīng)過(guò)短暫恢復(fù)后最終穩(wěn)定在61.80%。

在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，R2反應(yīng)器表現(xiàn)出明顯的厭氧氨氧化被有機(jī)物抑制的現(xiàn)象，其抑制閾值顯著低于文獻(xiàn)報(bào)道的水平。前期研究表明，生物炭投量大于10g/L時(shí)對(duì)厭氧氨氧化以及反硝化都有明顯的促進(jìn)作用。R2反應(yīng)器的生物炭填料投加量達(dá)到了22.5g/L，這可能導(dǎo)致反硝化菌的持續(xù)增殖，使其競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)超過(guò)厭氧氨氧化菌，進(jìn)而成為R2反應(yīng)器性能下降的重要原因之一。

在第63天，通過(guò)對(duì)兩個(gè)反應(yīng)器內(nèi)活性污泥進(jìn)行15N同位素分析，評(píng)估了厭氧氨氧化活性及其對(duì)脫氮的貢獻(xiàn)率。29N2為厭氧氨氧化途徑生成，30N2為反硝化途徑生成。R1反應(yīng)器污泥樣品的29N2和30N2峰面積濃度分別為0.2732和0.0141mAU/min，R2反應(yīng)器中污泥樣品分別為0.1597和0.0055mAU/min。由于此時(shí)R1反應(yīng)器仍投加有機(jī)物供反硝化菌作為電子供體，其反硝化活性也明顯高于R2反應(yīng)器。具體而言，R1反應(yīng)器中厭氧氨氧化對(duì)脫氮的貢獻(xiàn)率為95.1%，而反硝化僅占4.9%。相比之下，R2反應(yīng)器中厭氧氨氧化的貢獻(xiàn)率為96.7%，反硝化的貢獻(xiàn)率為3.3%。盡管R2反應(yīng)器中厭氧氨氧化占優(yōu)勢(shì)，但整體來(lái)看其脫氮性能仍不如R1。值得注意的是，即使在未投加有機(jī)物的情況下，反硝化反應(yīng)仍占據(jù)了一定比例，這表明在自養(yǎng)反應(yīng)器中存在利用死亡細(xì)菌的異養(yǎng)反硝化過(guò)程。

2.2 污泥與生物膜形貌

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)活性污泥與生物膜的掃描電鏡結(jié)果如圖3所示。R1反應(yīng)器的活性污泥主要由桿菌、球狀菌和黏性物質(zhì)構(gòu)成。活性污泥中原有的厭氧氨氧化球菌聚集體表面附著了一定數(shù)量的不規(guī)則球菌和桿菌，在有機(jī)物存在的條件下，異養(yǎng)菌群發(fā)生了增殖，并且更傾向于在污泥外層靠近有機(jī)物的生態(tài)位中生長(zhǎng)。R2反應(yīng)器活性污泥主要由球狀菌和黏性物質(zhì)組成。活性污泥中原有的球菌聚集體表面附著了大量不規(guī)則球菌，其數(shù)量明顯多于R1反應(yīng)器。掃描電鏡觀(guān)察顯示，不規(guī)則的小聚集體菌群幾乎完全覆蓋了原有的球菌聚集體表面，異養(yǎng)微生物占據(jù)了更多的生態(tài)位，這一現(xiàn)象與R2反應(yīng)器的脫氮效率下降相一致。同時(shí)，通過(guò)高倍數(shù)掃描電鏡圖像發(fā)現(xiàn)，R1反應(yīng)器生物膜上的污泥絮體比其他樣本更大，形成了更大的集合體，這使得R1反應(yīng)器在污泥結(jié)構(gòu)方面更加穩(wěn)定。

2.3 胞外聚合物

為了解投加有機(jī)物后反應(yīng)器內(nèi)污泥的變化趨勢(shì)，按照試驗(yàn)前期（階段1）、中期（階段2）和后期（階段3）三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，即取樣時(shí)間分別為試驗(yàn)第1天、第28天以及第60天（R2反應(yīng)器脫氮效率恢復(fù)至試驗(yàn)前期約80%的時(shí)間點(diǎn)），對(duì)活性污泥的EPS含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

在試驗(yàn)前期，R1反應(yīng)器的活性污泥和生物膜EPS含量分別為672.73和276.08mg/g，R2反應(yīng)器為123.74和241.47mg/g。R1反應(yīng)器中活性污泥EPS含量較高，可能緣于接種生物膜脫落而導(dǎo)致的有機(jī)物釋放。R2反應(yīng)器中多糖組分含量較少，這可能是因?yàn)槠渖锬ず突钚晕勰嘈躞w處于初期形成階段，微生物間尚未通過(guò)EPS建立穩(wěn)定的聯(lián)系。此外，生物炭提供的微量元素和無(wú)機(jī)碳減輕了R2反應(yīng)器微生物系統(tǒng)的壓力，導(dǎo)致EPS含量較低。在IFAS中，PN/PS值可用于評(píng)估厭氧氨氧化污泥的穩(wěn)定性和強(qiáng)度。R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的PN/PS值分別為0.62和1.57，而R2反應(yīng)器對(duì)應(yīng)值為2.53和1.96，生物膜和R2反應(yīng)器活性污泥的PN/PS較高，表明這些生態(tài)位的結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。

在試驗(yàn)中期，R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的EPS含量分別為363.82和556.15mg/g，R2反應(yīng)器的為233.16和631.97mg/g。R1反應(yīng)器中活性污泥EPS含量減少的原因可能是異養(yǎng)微生物利用EPS作為碳源。R2反應(yīng)器中活性污泥EPS含量大幅增加，主要緣于多糖含量的顯著增長(zhǎng)，這與投加有機(jī)物引起的菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。在厭氧氨氧化體系中，往往存在較高的TB-EPS含量和PN/PS值，即較高的TB-PN值，而該值又可作為厭氧氨氧化菌群變化的一個(gè)重要指標(biāo)。該階段R2反應(yīng)器的TB-PN含量與試驗(yàn)前期不相上下，表明原有厭氧氨氧化菌群仍占一定比例。R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的PN/PS分別為2.09、1.45，R2反應(yīng)器的為0.60和0.70。R1反應(yīng)器的PN/PS較高，表明在投加有機(jī)物后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，活性污泥PN/PS顯著增加可能與異養(yǎng)反硝化菌的黏附性有關(guān)。而R2反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的PN/PS顯著下降，這是因?yàn)樯锾吭鰪?qiáng)了反硝化菌活性，異養(yǎng)反硝化菌開(kāi)始搶占厭氧氨氧化菌的生態(tài)位，導(dǎo)致原有結(jié)構(gòu)被破壞。

在試驗(yàn)后期，R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的EPS含量分別為270.82和648.94mg/g，R2反應(yīng)器的對(duì)應(yīng)值為271.94和398.75mg/g。R1反應(yīng)器中生物膜EPS含量持續(xù)上升，而活性污泥EPS含量持續(xù)下降，表明活性污泥中微生物數(shù)量因投加有機(jī)物而增加，生物膜中TB-PN占比下降則代表原有厭氧氨氧化菌群比例減少。R2反應(yīng)器中多糖含量顯著減少，表明在恢復(fù)自養(yǎng)環(huán)境后，異養(yǎng)反硝化菌數(shù)量減少，而后單一厭氧氨氧化反應(yīng)器中多糖含量通常較低。R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的PN/PS分別為1.58、0.81，R2反應(yīng)器為1.24、0.81。R1反應(yīng)器中活性污泥和生物膜的PN/PS下降，異養(yǎng)微生物的加入減弱了單一厭氧氨氧化菌群的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。R2反應(yīng)器的PN/PS在停止投加有機(jī)物后有所上升，但未達(dá)到試驗(yàn)前期的水平，這表明厭氧氨氧化群落結(jié)構(gòu)具備一定的恢復(fù)能力。

2.4 胞外聚合物組分的熒光特性

在第60天，對(duì)R1、R2反應(yīng)器活性污泥和生物膜樣品（依次記作S1、S2、S3、S4）進(jìn)行熒光光譜分析。熒光強(qiáng)度與EPS的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，能夠間接反映EPS中活性官能團(tuán)及其組分的特性。結(jié)果顯示，EPS中共檢測(cè)到4種熒光組分，即：溶解性的類(lèi)酪氨酸物質(zhì)C1（λEm/λEx=310/275nm）、難分解的類(lèi)酪氨酸蛋白類(lèi)物質(zhì)C2（λEm/λEx=310/225nm）、溶解性的類(lèi)色氨酸物質(zhì)C3（λEm/λEx=340/275nm）、難分解的類(lèi)色氨酸蛋白類(lèi)物質(zhì)C4（λEm/λEx=340/225nm）。

色氨酸和酪氨酸是EPS中的重要氨基酸組分。色氨酸的疏水性使得其在細(xì)胞黏附過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，色氨酸蛋白對(duì)污泥顆粒化和生物膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有重要貢獻(xiàn)。色氨酸主要存在于TB-EPS中，這與厭氧氨氧化系統(tǒng)中TB-EPS占比較高的特性相符。S1~S4的MLSS濃度分別為791.4、240、1048.5和482.8mg/L，4個(gè)樣品的色氨酸熒光強(qiáng)度與污泥濃度呈正相關(guān)。酪氨酸在細(xì)胞肉芽的形成中發(fā)揮重要作用，并且已被證實(shí)可作為電子介質(zhì)促進(jìn)厭氧氨氧化系統(tǒng)的內(nèi)源反硝化過(guò)程。酪氨酸能夠加速酶中的電子轉(zhuǎn)移，主要依靠其高度參與微生物的電子傳遞過(guò)程，并可作為硝酸鹽還原過(guò)程中的電子供體被系統(tǒng)利用。兩組系統(tǒng)活性污泥中酪氨酸的熒光強(qiáng)度均大于生物膜，或許表明內(nèi)源反硝化主要發(fā)生在活性污泥中。

2.5 有機(jī)物對(duì)微生物酶活的影響

微生物酶活及相關(guān)指標(biāo)變化如圖5所示。在試驗(yàn)前期，R2反應(yīng)器的生物膜樣品表現(xiàn)出最高的INT-ETS活性，其次是R1反應(yīng)器的活性污泥。INTETS活性反映了微生物呼吸鏈上的電子傳遞效率，其本質(zhì)是通過(guò)測(cè)定微生物的呼吸活性來(lái)間接評(píng)估活性污泥的生物活性。在試驗(yàn)中期，由于有機(jī)物的投加以及異養(yǎng)微生物呼吸活性顯著高于自養(yǎng)微生物，兩組反應(yīng)器的泥膜樣品INT-ETS活性均有所上升。在試驗(yàn)后期，R1反應(yīng)器由于持續(xù)投加有機(jī)物，異養(yǎng)反硝化菌與厭氧氨氧化菌的協(xié)同作用進(jìn)一步加深，兩者共同增殖并占據(jù)適宜的生態(tài)位，從而更有效地利用基質(zhì)。相比之下，R2反應(yīng)器在停止投加有機(jī)物后，INT-ETS活性未呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

DHA酶活在厭氧氨氧化污泥樣品中代表了微生物的代謝活性和生物降解能力。由圖5（b）可知，在試驗(yàn)前期，污泥樣品的DHA酶活普遍較低。這主要是由于自養(yǎng)型環(huán)境中有機(jī)物來(lái)源有限，主要依賴(lài)于EPS和死亡細(xì)胞。在試驗(yàn)中期，隨著有機(jī)物的投加，兩組樣品的DHA酶活均有所增長(zhǎng)。這表明在有機(jī)物存在的條件下，污泥的有機(jī)物降解活性顯著提升。在試驗(yàn)后期，R2反應(yīng)器在停止投加有機(jī)物后，DHA酶活性變化不大。

由圖5（c）可知，在試驗(yàn)中期，兩組反應(yīng)器泥膜樣品的AMO酶活均有所增長(zhǎng)，即提高C/N能夠提升厭氧氨氧化反應(yīng)器的AMO酶活。在試驗(yàn)后期，當(dāng)R2反應(yīng)器停止投加有機(jī)物后，AMO酶活性變化不大。試驗(yàn)中期和后期的硝化活性較試驗(yàn)前期均提升較多，這是因?yàn)樘砑由倭坑袡C(jī)物可以改善微生物生存環(huán)境，提高自養(yǎng)硝化菌的活性，即使去除外源有機(jī)物，硝化菌群已通過(guò)協(xié)同作用形成穩(wěn)定的功能結(jié)構(gòu)，維持較高的硝化活性。

由圖5（d）可知，在試驗(yàn)前期，R1和R2反應(yīng)器的NOS酶活均較低。在試驗(yàn)中期，R1和R2反應(yīng)器的NOS酶活均顯著增長(zhǎng)，其中R2反應(yīng)器生物膜的NOS酶活最高，這與生物炭增強(qiáng)反硝化活性的研究結(jié)果一致。在試驗(yàn)后期，R1反應(yīng)器的NOS酶活有所下降，但仍顯著高于試驗(yàn)前期的水平，經(jīng)過(guò)更長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)，厭氧氨氧化菌的競(jìng)爭(zhēng)力逐漸恢復(fù)，導(dǎo)致NOS酶活未能維持在高水平。而R2反應(yīng)器的NOS酶活下降更為明顯，甚至低于試驗(yàn)前期的水平。說(shuō)明停止投加有機(jī)物后，反硝化菌活性明顯減弱。

由圖5（e）可知，在試驗(yàn)前期，R2反應(yīng)器生物膜和R1反應(yīng)器活性污泥的HZO酶活最高。在試驗(yàn)中期投加有機(jī)物后，HZO酶活變化不大。在試驗(yàn)后期，R1反應(yīng)器經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)后，HZO酶活較高，厭氧氨氧化菌群競(jìng)爭(zhēng)力加強(qiáng)；R2反應(yīng)器的酶活則保持相對(duì)穩(wěn)定。

由圖5（f）可知，兩組反應(yīng)器泥膜樣品的血紅素濃度與HZO酶活趨勢(shì)基本一致。血紅素是一個(gè)非常重要的輔助因子，參與厭氧氨氧化菌的主要代謝反應(yīng)，具有催化和電子轉(zhuǎn)移電位的能力，可以作為評(píng)價(jià)厭氧氨氧化性能的指標(biāo)，通過(guò)血紅素指標(biāo)可以同時(shí)確定，在低有機(jī)物投加量下厭氧氨氧化的活性仍可以保持。

2.6 微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

在試驗(yàn)前期（R1活性污泥D1、R1生物膜D2、R2活性污泥D3、R2生物膜D4）和結(jié)束階段（R1活性污泥E1、R1生物膜E2、R2活性污泥E3、R2生物膜E4）分析了污泥和生物膜樣品中微生物群落的Alpha多樣性指數(shù)，8個(gè)樣品的覆蓋度均大于0.99，表明檢測(cè)結(jié)果具有絕對(duì)的可靠性。其中，Chao指數(shù)和ACE指數(shù)值越大說(shuō)明物種數(shù)越多；Shannon指數(shù)表示生物群落的復(fù)雜程度，其值越大說(shuō)明群落復(fù)雜程度越高。在試驗(yàn)前期（D組），D1樣品的Shannon多樣性（5.00）最低，D4多樣性（5.48）最豐富，這可能與生物炭豐富的微環(huán)境有關(guān)。在加入有機(jī)物兩個(gè)月后的樣品（E組）中，E1、E2和E3的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)都增加，E1、E2和E3的ACE指數(shù)分別由D1、D2和D3的1396、1281和1363上升為1501、1358和1475，Chao指數(shù)由1396、1256和1329上升為1485、1358和1462，表明種群數(shù)量都增加，同時(shí)代表多樣性的Shannon指數(shù)也在同步增加，由5.003、5.290和5.134上升為5.749、5.412和5.544。這表明在投加有機(jī)物后，異養(yǎng)微生物增殖的同時(shí)原有的自養(yǎng)微生物也完好留存；而僅E4樣本的三種指數(shù)變化相反，ACE、Chao和Shannon指數(shù)分別由1471、1423和5.481下降為1304、1249和4.823，加入有機(jī)物后R2反應(yīng)器生物膜由于生物炭對(duì)反硝化菌的強(qiáng)化作用，反硝化菌獲得了較多的生長(zhǎng)空間，使得菌群物種數(shù)量下降。

兩階段門(mén)水平的微生物群落組成如圖6所示。在試驗(yàn)前期，活性污泥和生物膜中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria（變形菌門(mén)）、Chloroflexi（綠彎菌門(mén)）、Patescibacteria（髕骨菌門(mén)）、Bacteroidota（擬桿菌門(mén)）和Firmicutes（厚壁菌門(mén)）；在試驗(yàn)結(jié)束階段，活性污泥和生物膜中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidota、Patescibacteria、Planctomycetota（浮霉菌門(mén)）。兩個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)類(lèi)似，厭氧氨氧化菌作為Planctomycetota中的一類(lèi)厭氧革蘭氏陰性細(xì)菌，在R1反應(yīng)器活性污泥和生物膜中的豐度較低。Proteobacteria和Bacteroidota在污水生物脫氮中起著關(guān)鍵作用，Proteobacteria大多數(shù)為兼性厭氧菌，它們可以在低溶解氧條件下進(jìn)行代謝和生長(zhǎng)，有利于營(yíng)造厭氧環(huán)境；Bacteroidota可以降解大分子碳水化合物，多為專(zhuān)性厭氧菌群，有助于降低系統(tǒng)中有機(jī)物的量。Chloroflexi多為絲狀菌，具有極其多樣的營(yíng)養(yǎng)方式，易與其他微生物形成聚合體，并且廣泛存在于A(yíng)nammox系統(tǒng)中，可以為Anammox顆粒的形成提供骨架支持。Patescibacteria相關(guān)菌屬可以利用Candidatus_Brocadia產(chǎn)生的聚乙酰氨基葡萄糖中的一部分作為能量來(lái)源維持自身代謝。而D組中的Firmicutes數(shù)量大幅減少，該菌在反硝化菌群中發(fā)揮重要作用，投加有機(jī)物后失去了競(jìng)爭(zhēng)力。

試驗(yàn)前期（D組）和試驗(yàn)結(jié)束（E組）屬水平微生物群落組成如圖7所示。兩個(gè)反應(yīng)器活性污泥和生物膜中的厭氧氨氧化菌以Candidatus_Brocadia和Candidatus_Jettenia為主，由于Candidatus_Brocadia比Candidatus_Jettenia更適應(yīng)低濃度環(huán)境，故在試驗(yàn)低濃度的環(huán)境下豐度更高；Candidatus_Jettenia則常常在市政污水處理廠(chǎng)中出現(xiàn)，該菌的增殖可能與接種市政污水廠(chǎng)的二沉池污泥相關(guān)。在試驗(yàn)前期Candidatus_Jettenia與Candidatus_Brocadia的相對(duì)豐度差別不大，在試驗(yàn)中期投加有機(jī)物后，R1和R2反應(yīng)器活性污泥和生物膜4個(gè)樣品中Candidatus_Brocadia的相對(duì)豐度分別為4.00%、1.01%、1.26%和16.43%，Candidatus_Jettenia的相對(duì)豐度分別為0.98%、1.43%、1.34%、6.76%，Candidatus_Brocadia的相對(duì)豐度在兩個(gè)反應(yīng)器中都大幅上升。在投加有機(jī)物后，厭氧氨氧化菌總體相對(duì)豐度的增長(zhǎng)也證實(shí)了低濃度有機(jī)物對(duì)厭氧氨氧化菌的增殖有一定的促進(jìn)作用。

在其他菌屬方面，Denitratisoma作為一種可以利用死亡細(xì)菌的異養(yǎng)反硝化菌，在R2反應(yīng)器中的相對(duì)豐度增加更明顯。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，另一種典型異養(yǎng)反硝化菌Thauera獲得了較高的豐度，該菌被發(fā)現(xiàn)常常出現(xiàn)在異養(yǎng)微生物反應(yīng)器中并發(fā)揮短程反硝化作用，4個(gè)樣品中的相對(duì)豐度分別為1.08%、1.80%、0.86%和3.11%。更高的反硝化菌豐度反映了R2反應(yīng)器中脫氮效果變差與反硝化菌增殖使得厭氧氨氧化菌失去競(jìng)爭(zhēng)力相關(guān)。Exiguobacterium屬于兼性厭氧菌，具有一定分解有機(jī)物和好氧硝化的能力，可以在一些極端環(huán)境中生存，在投加有機(jī)物后失去了競(jìng)爭(zhēng)力。OLB17是一種電化學(xué)活性微生物，同時(shí)具有反硝化的能力，在反應(yīng)器投加有機(jī)物前后其豐度變化不大，在反應(yīng)器中利用AnAOB產(chǎn)生的NO3--N進(jìn)行反硝化反應(yīng)。norank_f__norank_o__SBR1031豐度增加較多，它的主要作用是清理細(xì)胞分泌或裂解產(chǎn)生的有機(jī)物，是一種特殊的保護(hù)菌群。在投加有機(jī)物后，一些試驗(yàn)前期豐度較低的微生物開(kāi)始繁殖，norank_f__norank_o__SJA-15作為一種典型的絲狀菌，在E組的相對(duì)豐度較高，其作為異養(yǎng)細(xì)菌可以降解有機(jī)物。norank_f__SC-I-84屬于β-變形菌群，在豐度增加時(shí)，其貢獻(xiàn)出較高的氨同化效率。總之，在R2反應(yīng)器中尤其是生物膜上孕育了反硝化菌的生長(zhǎng)繁殖，又結(jié)合15N同位素分析發(fā)現(xiàn)的反硝化脫氮貢獻(xiàn)率僅為3.3%，可以證明R2反應(yīng)器僅為反硝化菌提供了生長(zhǎng)環(huán)境，卻并未發(fā)揮明顯的脫氮作用。

3、結(jié)論

①兩個(gè)反應(yīng)器在投加有機(jī)物的過(guò)程中出現(xiàn)了不同響應(yīng)：R1反應(yīng)器的總氮去除率穩(wěn)定在69.88%，R2反應(yīng)器的總氮去除率在第1~34天為67.61%，而第35~37天下降為55.16%，并且在不投加有機(jī)物后不可恢復(fù)。15N同位素測(cè)試結(jié)果表明R1反應(yīng)器的厭氧氨氧化活性遠(yuǎn)高于R2反應(yīng)器。在試驗(yàn)前期，R1和R2反應(yīng)器活性污泥中的反硝化菌以不規(guī)則球菌黏附在厭氧氨氧化菌表面，且R2中反硝化菌的過(guò)度增殖顯著取代了原有菌群，使得脫氮效率下降。

②投加有機(jī)物后，2個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的EPS含量整體增加，活性污泥和生物膜中EPS組分相同，主要為酪氨酸和色氨酸。色氨酸的疏水性對(duì)細(xì)胞的黏附至關(guān)重要，酪氨酸則在細(xì)胞肉芽的形成中起重要作用。

③低濃度有機(jī)物的投加導(dǎo)致反應(yīng)器中微生物群落發(fā)生顯著的演替和分化，Candidatus_Brocadia和Candidatus_Jettenia是反應(yīng)器中主要的厭氧氨氧化菌屬。投加有機(jī)物后，R2反應(yīng)器中經(jīng)典反硝化菌如Denitratisoma和Thauera相對(duì)豐度更高，與生物炭的刺激相關(guān)。