剩余污泥（ES）是污水生物處理過程中的重要副產物，若處置不當會影響生態環境。厭氧消化被認為是重要的污泥處理方式，其可有效實現污泥減量化、資源化和無害化。氫氣是厭氧發酵過程的重要價值產物，其被認為是化石燃料最有價值的替代品，因為它具有高能量密度（286kg/mol）和零燃燒排放。然而，水解過程緩慢及產生的氫氣極易被消耗成為污泥暗發酵產氫效率低的瓶頸問題。近年來，如何提高污泥暗發酵產氫備受關注。

礦化垃圾（AR）是垃圾填埋過程產生的副產物，其富含腐殖質、水解酶且微生物群落結構豐富。AR已被應用到滲濾液處理、餐廚垃圾處理、土壤石油污染修復等領域。謝明德等采用16SrRNA基因高通量測序技術證實了礦化垃圾層內點位的微生物豐富度相近，但多樣性差別較大，厚壁菌門占比較高。此外，礦化垃圾表面含有大量官能團及良好的孔隙結構，其對污染物具有良好的吸附性能。Zhao等應用AR促進了ES厭氧水解酸化過程，并證實了AR內水解酶具有重要作用。然而到目前為止，AR對ES暗發酵產氫的影響尚未見報道，且在AR影響下污泥發酵系統內微生物群落結構的演替規律也不清晰。為此，筆者以AR和ES為研究對象，在批式反應器內探究了AR對污泥暗發酵產氫的影響及相關機制。首先，分析了AR含量對污泥暗發酵產氫性能的影響；然后，通過分析不同組別內溶解性有機物的釋放、揮發性脂肪酸（VFA）濃度的變化、關鍵酶活性及微生物群落特征的變化規律揭示AR強化污泥暗發酵產氫機制。

1、材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用污泥為上海某城鎮污水處理廠初沉池和二沉池混合后的污泥，ES經過濾去掉雜質后靜置48h，去掉上清液。污泥特性：pH為6.8±0.2，總懸浮固體（TSS）為（15.6±0.2）g/L，揮發性懸浮固體（VSS）為（12.1±0.1）g/L，溶解性COD為（152±6.5）mg/L，VFA為（51±2.3）mg/L。

接種污泥取自上海某高校長期運行的厭氧反應器，該反應器在中溫（35℃）條件下連續運行半年，污泥停留時間為20d。該反應器主要用于厭氧處理城鎮有機固廢（污泥、廚余垃圾），氫氣產量約為10.2mL/gVSS。接種污泥特性：pH為7.1±0.1，TSS為（18.2±2.5）g/L，VSS為（16.5±1.6）g/L，溶解性COD為（245±12）mg/L，VFA為（135±8）mg/L。

AR取自上海某垃圾填埋場封存區填埋齡為10年的垃圾。取回后的AR經篩分去掉大顆粒雜質后用粉碎機粉碎至粉末狀備用。AR特性：pH為7.2，TSS為34.2g/L，腐殖質為13.2g/L，Cu為0.04mg/g，Ni為0.05mg/g，Zn為3.2mg/g。

1.2 實驗方法

實驗在有效體積為2.0L的厭氧反應器內進行。首先向各反應器內接種1.0L的接種污泥和0.5L的ES。接種污泥在使用前先進行120℃加熱10min預處理過程，以抑制產甲烷菌活性。然后向各反應器內投加AR，使AR初始含量分別為0（空白組）、3%、6%、9%和12%（以污泥TSS質量計）。待物料投加完畢后，向各反應器充入高純氮氣60s，保證嚴格厭氧環境。隨后用橡膠塞密封各反應器，再轉移至恒溫振蕩箱進行暗發酵。發酵溫度控制在（35±2）℃。待各組別氫氣累計產量增加不明顯時，取污泥樣品進行微生物高通量測序。

1.3 分析方法

TSS、VSS和COD參照《水和廢水監測分析方法》（第4版）測定；多糖和蛋白質分別采用苯酚-硫酸法和BCA蛋白質測定試劑盒測定；VFA采用帶有火焰離子化檢測器（FID）的氣相色譜儀分析；蛋白酶、淀粉酶、磷酸轉移乙酰酶（PTA）及輔酶F420的活性測定方法參照文獻；使用IlluminaHiSeq平臺通過16SrRNA基因測序比較不同AR暴露組別內微生物的群落特征，具體方法見文獻。

2、結果與討論

2.1 AR對污泥暗發酵產氫氣的影響

AR對污泥暗發酵產氫氣的影響如圖1所示。在0~6d，各組的氫氣產量均急劇升高。穩定階段空白組的氫氣產量為12.5mL/g，與之前的文獻報道大致相似。AR的存在促進了污泥暗發酵產氫，且影響程度與AR含量密切相關。當AR含量由3%提高至9%時，氫氣產量由13.5mL/g提高至15.6mL/g。然而進一步提高AR含量至12%時，氫氣產量卻下降至10.6mL/g，低于空白組。高含量AR降低了氫氣產量的原因可能是AR內含有的重金屬等抑制了產氫微生物活性，降低了有機物向氫氣的生物轉化。此外，AR內幾乎不含有機物，因此AR自身降解對產生氫氣的貢獻可以忽略。上述實驗結果證實，AR對污泥暗發酵產氫具有促進作用，當AR含量為9%時，氫氣最大產量為15.6mL/g，約為空白組的1.25倍。

2.2 AR對污泥水解過程的影響

水解是污泥暗發酵產氫的限速步驟，ES內有機物主要以顆粒態或非溶解態存在，而污泥暗發酵過程中微生物更易吸收或轉化溶解態有機質。圖2為AR對污泥暗發酵過程中SCOD濃度的影響。

由圖2可知，SCOD含量隨發酵時間呈先升高后平穩波動的變化趨勢。空白組SCOD含量在5d內升至2451mg/L。當存在AR時，SCOD含量急劇升高，且升高程度與AR含量有關。當AR含量為3%時，SCOD濃度升高至3645mg/L，繼續提高AR含量至9%，SCOD濃度升高至4265mg/L，說明AR提高了污泥暗發酵過程中有機物的溶出量，從而為產氫微生物提供了充足的物質保障。有研究證實，AR含有的水解酶和腐殖質促進了污泥內顆粒狀有機物的生物轉化，從而提高了SCOD濃度。但當AR含量提高至12%時，SCOD最大濃度為4156mg/L，低于AR含量為9%的，但仍高于空白組。高劑量AR含有的重金屬如Cu、Cd、Ni等會對水解酶活性產生抑制，進而降低有機物溶出量。AR含有的重金屬一方面可作為微量元素強化厭氧發酵，另一方面過量的重金屬對污泥厭氧消化過程中有機物的生物利用、微生物代謝活性、關鍵酶活性的表達均具有抑制作用。此外，過量投加AR會導致重金屬在沼渣中殘留，在后續沼渣處理中可能引發環境生態風險。因此，在應用AR強化ES資源化利用時需考慮投量，避免過度使用給污泥處理與處置帶來風險。

AR對污泥暗發酵過程中溶解性蛋白質和多糖濃度的影響如圖3所示。

由圖3可知，AR同樣提高了污泥中溶解性蛋白質和多糖的濃度。當AR含量為9%時，溶解性蛋白質和多糖的最大濃度分別為2903和1195mg/L，顯著高于空白組的1054和694mg/L。當AR含量為12%時，溶解性蛋白質和多糖的最大含量分別為2150和945mg/L，高于空白組但是低于AR含量為6%的結果。AR含有能降解難生物降解物質的水解酶，進而促進了蛋白質和多糖物質的溶解。可利用溶解性有機物的增加為產氫細菌提供了充足的基質，從而提高了氫氣產量。

2.3 AR對污泥暗發酵液的影響

AR對污泥暗發酵過程中VFA濃度的影響如圖4所示。

由圖4可知，在空白組和低AR含量組中，VFA濃度均隨發酵時間先升高后趨于穩定，而當AR暴露劑量超過6%時，VFA濃度隨時間先升高后下降。空白組VFA的最大值為612mg/L；當AR含量為3%時，VFA最大濃度提高至861mg/L；進一步提高AR含量至9%時，VFA最大含量提高至1911mg/L。AR的存在使VFA濃度提高的原因可歸于以下3個方面：①AR促進了暗發酵系統的水解過程，提高了發酵液中可利用有機物含量，為產酸微生物提供物質保障；②AR含有大量腐殖質（富里酸、胡敏酸等），研究證實腐殖質的存在有利于促進污泥酸化過程，從而提高了VFA積累量；③AR含有的腐殖酸、重金屬能抑制產甲烷菌的代謝活性，從而降低了VFA消耗。然而，當AR含量升高至12%時，VFA卻下降至1036mg/L，但仍高于空白組。高含量AR降低VFA濃度的原因可能在于AR中含有的大量重金屬抑制了酸化微生物的代謝，并抑制了酸化過程酶活性的表達。VFA是酸化過程的重要產物，其含量在一定程度上表征了污泥暗發酵酸化程度。當AR含量為9%時，VFA含量最大，表明適量的AR提高了污泥酸化程度。

AR對污泥暗發酵過程中VFA各組分占比的影響如圖5所示（以第5天為例）。乙酸鹽和丁酸鹽是VFA的主要組成部分，兩者占比之和高達53.8%~63.5%。AR的存在能影響VFA的構成。第5天時，空白組的乙酸鹽和丁酸鹽占比分別為32.5%和21.3%；當AR為6%時，乙酸鹽占比提高至35.6%，丁酸鹽占比略下降至20.3%。當AR含量為12%時，乙酸鹽占比提高至40.6%，丁酸鹽占比為22.9%。可見，適當含量的AR提高了VFA中乙酸鹽占比，而略微降低了丁酸鹽占比；但高含量AR導致污泥暗發酵過程中VFA內乙酸鹽和丁酸鹽占比均升高。乙酸鹽占比增加表明酸化過程被加速，說明AR的存在提高了產氫產乙酸過程，產氫產乙酸過程的強化在一定程度上能提高氫氣產量，這也是AR含量為9%組別內氫氣產量最高的原因之一。

2.4 AR對暗發酵過程中關鍵酶活性的影響

ES暗發酵產氫氣過程需要多種關鍵酶，其中蛋白酶和淀粉酶與污泥內蛋白質和多糖的生物降解密切相關，PTA與乙酸鹽的生物合成密切相關，產甲烷過程需要輔酶F420。AR對污泥暗發酵過程中關鍵酶活性的影響如圖6所示。可知，AR的存在提高了與生物產氫相關關鍵酶的活性。當AR含量為9%時，蛋白酶、淀粉酶和PTA的相對活性分別提高至124.6%、118.5%和107.5%，說明適量AR的存在提高了水解酸化過程，這與圖2結果一致。當AR含量為12%時，蛋白酶和淀粉酶的相對活性分別為118.5%和113.4%，低于AR含量為9%的，但PTA相對活性為108.7%，略高于AR含量為9%的。至于輔酶F420活性，AR的存在降低了F420活性，且AR含量越高，對F420活性的抑制越顯著。尤其當AR含量為12%時，F420的相對活性下降至64.5%，說明AR降低了產甲烷菌的活性，減少了氫氣的消耗。AR含量為9%和12%的F420相對活性差異不顯著，但AR含量為9%時水解過程被顯著加速，這也導致其氫氣產量最大。

2.5 AR對暗發酵過程中微生物群落特征的影響

AR對污泥暗發酵過程中微生物群落在門水平上的影響見圖7。可以看出，Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria和Chloroflex是主要的門水平微生物，約占48.5%~60.7%。AR的存在影響了微生物群落結構。尤其當AR含量由0提高至6%時，Firmicutes的相對豐度由18.6%增長至23.6%；當AR含量提高至9%時，Proteobacteria的相對豐度由12.3%提高至17.6%。有研究證實，Firmicutes是水解過程中主要的菌群，而Proteobacteria、Bacteroidota和Firmicutes是酸化過程的主要菌群。Firmicutes對有機物的水解酸化具有重要作用。AR內水解酶促進了有機物的水解，提高了污泥暗發酵系統內負責水解酸化過程微生物的相對豐度，進而提高了氫氣產量。

AR對污泥暗發酵過程中微生物群落在屬水平上的影響如圖8所示。

由圖8可知，AR同樣顯著影響了微生物在屬水平上的分布。Bacteroides是一種水解微生物，能促進海藻酸鹽、槐脂等大分子多糖的水解。AR的存在提高了Bacteroides的相對豐度，尤其當AR含量為9%時，其相對豐度提高至4.1%，顯著高于空白組的3.2%。此外，Gallicola在各組別中的占比均超過2.0%，且AR的存在進一步提高了其相對豐度。當AR含量提高至9%時，Gallicola的相對豐度提高至2.6%，高于空白組的2.1%。Gallicola是與產氫密切相關的微生物，其相對豐度的增加提高了氫氣產量。可見，AR提高了與水解酸化過程相關的關鍵微生物的相對豐度，進而提高了氫氣產量。

3、結論

AR提高了污泥發酵系統的氫氣產量，當AR含量為9%時，氫氣最大產量為15.6mL/g，約為空白組的1.25倍。AR促進了污泥暗發酵系統內水解酸化過程，提高了溶解性有機物的釋放量。當AR含量為9%時，溶解性COD、溶解性蛋白質和多糖含量分別為4265、2903和1195mg/L，均顯著高于空白組。AR可提高與水解酸化過程相關關鏈酶的活性。在門水平上，AR提高了Firmicutes和Proteobacteria的相對豐度；在屬水平上，提高了Bacteroides和Gallicola的相對豐度。