厭氧氨氧化(anaerobicammoniumoxidation，ANAMMOX)是一種環境友好的新型生物脫氮工藝，有效解決了傳統生物脫氮工藝碳源需求大和能耗成本高的問題，被認為是21世紀最具發展前景的生物脫氮工藝之一。然而，作為ANAMMOX工藝的關鍵功能菌，厭氧氨氧化菌生長緩慢，生長速率遠低于其他脫氮細菌，且對溫度、pH和DO等外界環境的要求十分苛刻，使其不得不面臨工藝啟動困難，菌種來源匱乏等問題，極大地限制了厭氧氨氧化成為污水處理的主流工藝。ANAMMOX污泥的儲存可有效保留厭氧氨氧化菌(AnAOB)，活化后的ANAMMOX儲存污泥是厭氧氨氧化工藝可靠的菌種來源之一。因此，在室溫條件下對厭氧氨氧化污泥進行較長時間的儲存，并研究能在短期內使其脫氮活性快速恢復的方法，對厭氧氨氧化工藝的工程化應用具有重要意義。

目前厭氧氨氧化污泥的活性恢復主要面臨著2個方面的問題：一是儲存時間越長，污泥的脫氮性能越低，需要的恢復時間越長。黃佳路等研究發現ANAMMOX污泥的比厭氧氨氧化活性隨儲存時間呈近乎線性下降(r2為0.978)。二是厭氧氨氧化菌在恢復過程中容易被N2氣泡攜帶而從反應器中洗脫，導致生物質的漂浮。有研究表明，AnAOB分泌的胞外聚合物可以使其緊密附著在生物填料上，從而有效緩解反應器內部的細胞沖刷現象，增強系統的生態穩定性和機械穩定性。然而，關于填料對長期儲存后的ANAMMOX污泥活性恢復的影響研究較為稀缺。

本研究將活性良好的厭氧氨氧化污泥置于室溫(15~30℃)條件下進行為期9個月的長期儲存，儲存過程中不提供任何微生物生長所需的基質。通過比較添加不同填料的厭氧氨氧化反應器的污泥顏色變化、脫氮效果和微生物群落特征等情況，探究長期室溫儲存后的厭氧氨氧化污泥的活性恢復能力，分析填料在恢復過程中發揮的作用，以期為長期室溫儲存后的ANAMMOX污泥的活性快速恢復提供理論依據和技術指導。

1、材料與方法

1.1 接種污泥

儲存前的厭氧氨氧化污泥取自某工廠厭氧氨氧化脫氮裝置，污泥濃度2250mg·L-1，呈紅褐色，有良好的沉降性能和厭氧氨氧化活性。將該厭氧氨氧化污泥在室溫條件下避光密封儲存9個月，期間室內環境最高溫度為30℃，最低溫度為15℃。

污泥活性恢復前，用氨氮和亞硝態氮濃度均為10mg·L-1的培養液清洗3遍，接著將污泥粉碎，使其粒徑保持在1mm左右，增大其與培養液的接觸面積，強化污泥恢復過程中的生物反應。

1.2 實驗用水

本實驗采用人工配水，由(NH4)2SO4和NaNO2提供氮源，通過0.1mol·L-1 HCl控制pH在7.5~8.0.其他配水組分包括： ρ(NaHCO3)1250mg·L-1， ρ(MgSO4 ·7H2 O)300mg·L-1， ρ(KH2PO4)10mg·L-1， ρ(CaCl2)5.6mg·L-1，微量元素Ⅰ1mL·L-1，微量元素Ⅱ1mL·L-1.微量元素Ⅰ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(FeSO4 ·7H2 O)5000mg·L-1;微量元素Ⅱ成分： ρ(EDTA)5000mg·L-1， ρ(MnCl2 ·4H2 O)990mg·L-1， ρ(CuSO4 ·5H2 O)250mg·L-1， ρ(ZnSO4 ·7H2 O)430mg·L-1， ρ(CoCl2 ·6H2 O)240mg·L-1， ρ(Na2MoO4 ·2H2 O)220mg·L-1， ρ(NiCl2 ·6H2 O)190mg·L-1， ρ(H3BO4)14mg·L-1.本實驗在進水中額外投加了ρ(Ca2+)0.03mmol·L-1，以促進厭氧氨氧化菌分泌胞外聚合物，幫助受損的厭氧氨氧化菌群附著在填料上并完成再生。考慮到氮氣脫氧需要配置減壓閥、液氮鋼瓶等相對復雜的曝氣設備，每次脫氧需耗時20min左右，而采用無水Na2SO3進行化學脫氧只需攪拌15s即可達到目標脫氧效果，且化學脫氧的成本遠低于氮氣脫氧，故本研究采用了操作更便捷、成本更低、脫氧更快的無水亞硫酸鈉還原脫氧法。本實驗投加的無水Na2SO3濃度約為0.1g·L-1，結合相關文獻，該SO42-濃度對微生物和基質濃度幾乎不產生影響，反應式見式(1)。

活性恢復期間根據污泥脫氮效果，對進水濃度進行了3次提升，詳見表1.

1.3 實驗裝置

本實驗裝置如圖1所示，反應器采用有機玻璃材質，有效容積1.0L，其中，每組反應器污泥投加量為0.3L，水體體積為0.4L，容積交換率50%，水力停留時間24h。裝置接口處均采用硅膠密封，以保證反應器內的厭氧環境。通過恒溫水浴振蕩器將裝置溫度控制在(35±1)℃，并以120r·min-1的頻率振蕩，使反應器內部培養液分布均勻。反應器外部用錫紙包裹遮光，防止藻類滋生。

如圖2所示，R2和R3反應器內分別填充彗星纖維填料(比表面積1100m2 ·m-3)和K3填料(比表面積約500m2 ·m-3)作為生物載體。

1.4 檢測項目與方法

NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度分別采用納氏試劑分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法測定，總無機氮TIN=[NH4+-N]+[NO2--N]+[NO3--N]。污泥濃度采用重量法測定，pH采用便攜式pH計檢測。

采用16SrRNA高通量測序技術來研究厭氧氨氧化系統中的微生物多樣性和群落結構。樣品取自運行第35d的3組反應器中的ANAMMOX污泥。

2、結果與討論

2.1 恢復過程中污泥的顏色變化

紅色是厭氧氨氧化菌(AnAOB)最顯著的特征，活性恢復過程中污泥的顏色變化見圖3.厭氧氨氧化污泥在未補充基質的情況下經過9個月的室溫保存，結構變得細碎，顏色發黑，散發臭味，這是由于在無基質添加的厭氧氨氧化污泥儲存過程中，AnAOB的胞內血紅素不斷衰減，同時由于菌體死亡水解，黑色硫化物的含量增加，最終逐漸覆蓋住污泥原本的紅色外觀，使污泥呈現黑色。經過42d的運行，AnAOB利用包括細胞色素c在內的多種蛋白質，完成菌體的生長、繁殖和代謝，厭氧氨氧化活性明顯提高。R2和R3反應器中可看到明顯的紅色顆粒污泥以及紅色生物膜，而R1反應器中的污泥總體顏色較恢復前雖然發生了變化，但幾乎看不到紅色顆粒污泥。Kang等的研究發現色度與比厭氧氨氧化活性顯著相關(r=0.940)，可以作為一種直觀的厭氧氨氧化活性指標。在本研究中，R2和R3反應器內的厭氧氨氧化活性顯然更高。

2.2 活性恢復過程中污泥的脫氮效果

2.2.1 啟動階段

本研究采用低氮進水和較長水力停留時間來啟動恢復實驗，待污泥脫氮性能逐漸恢復后，再逐步提高進水基質濃度，提升系統脫氮負荷。各階段污泥脫氮效果和化學計量比變化見圖4.根據ANAMMOX反應的化學方程式，本實驗各階段進水NH4+-N和NO2--N的化學計量比均采用1∶1.32.

第Ⅰ階段(1~10d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別為50mg·L-1和66mg·L-1，水力停留時間HRT設定為24h。3組反應器經過短暫的適應之后脫氮性能均有提升，但處理效果不夠穩定，化學計量比波動較大。由圖4(d)可知，R2和R3反應器的氮去除效果明顯優于R1反應器。Zhang等的研究發現填料可以為微生物生長提供不同的生態位，實現氨氧化菌(AOB)和AnAOB等不同菌種的協同脫氮，故R2和R3反應器獲得了更高的氮去除率。在第8d和第10d時，R2和R3反應器內的NH4+-N和NO2--N同步去除率均達到90%以上，系統開始出現ANAMMOX反應，TIN去除率分別達82.25%和80.92%，R2反應器的脫氮性能略優于R3反應器。江宇勤等的研究指出生物膜的質量會受到載體的比表面積、生物親和性和表面粗糙度等理化性質的影響。相比于K3填料，彗星纖維填料具有更大的比表面積，且表面親和性更強，有利于微生物附著，故R2反應器的脫氮性能更佳。

第Ⅱ階段(11~15d)，考慮到恢復初期反應器運行效果不穩定，易因為氮負荷的過大波動而造成基質濃度抑制現象，第Ⅱ階段對進水基質濃度進行了小幅提升， ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別提高到80mg·L-1和105.6mg·L-1.圖4(e)顯示，該階段未添加填料的R1反應器的化學計量比與理論值相差最大，且波動最為明顯，原因系R1反應器中的AnAOB活性仍較低，尚未占據主導地位。

2.2.2 負荷提高和穩定運行階段

隨著ANAMMOX污泥脫氮性能的逐漸恢復，第Ⅲ階段(16~25d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)分別調整為200mg·L-1和264mg·L-1，水力停留時間HRT為24h。圖4(a)和圖4(b)顯示，氮負荷的大幅提高使3組反應器的氮去除效果均受到影響而降低，但與R1相比，R2和R3反應器受到的波動要小得多，添加填料的ANAMMOX反應器具有更強的生態穩定性和耐沖擊負荷能力。

為了進一步考察3組ANAMMOX反應器的脫氮穩定性，第Ⅳ階段(26~42d)，進水ρ(NH4+-N)和ρ(NO2--N)進一步提高到300mg·L-1和396mg·L-1。由圖4(d)和圖4(e)可知，與前幾個階段相比，第Ⅳ階段中3組反應器的TIN去除率波動幅度明顯減小，化學計量比逐漸趨近理論值(NO2--N/NH4+-N等于1.32，NO3--N/NH4+-N等于0.26)，ANAMMOX系統開始進入穩定運行階段。3組反應器經過42d的運行，脫氮性能均得到有效提升，TIN去除率分別達78.96%、84.92%和84.66%，NO2--N/NH4+-N分別為1.43、1.35和1.34，略高于理論值1.32，NO3--N/NH4+-N分別為0.21、0.24和0.23，略低于理論值0.26.王賢等的研究指出，不同反應裝置的化學計量比往往因為反應器類型、菌種的結構和狀態，所處環境條件不同而存在差異。一個良好的ANAMMOX系統往往是多菌種共同協作的脫氮過程，本實驗除了存在氨氧化菌(AOB)將NH4+-N轉化成NO2--N外，還存在部分反硝化菌將NO3--N轉化為NO2--N，使系統出現NO3--N/NH4+-N略低于理論值，而NO2--N/NH4+-N略高于理論值的現象。結果顯示，R2和R3反應器的TIN去除率顯著優于R1反應器，在長期室溫儲存的ANAMMOX污泥的活性恢復過程中，填料可以為微生物提供更加穩定的生長環境，增強ANAMMOX污泥抵抗不利環境的能力，提高ANAMMOX系統的脫氮穩定性。

2.3 微生物群落特征分析

2.3.1 門分類水平上菌群結構分析

圖5所示的是3組反應器在門水平上的微生物群落結構，優勢菌門(相對豐度>5%)為Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Planctomycetes(浮霉菌門)和Patescibacteria。AnAOB是化能自養型細菌，目前發現的AnAOB均屬于浮霉菌門，R1、R2和R3反應器中的浮霉菌門占比分別為3.79%、8.71%和8.86%。劉冰等的研究發現填料的理化特性可顯著影響脫氮功能菌(尤其是AnAOB)的富集效果及活性，添加填料的R2和R3反應器獲得了更高的浮霉菌門豐度。

此外，在3組反應器中，變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)均占據了很大的比例(圖6)，這與多數研究中的厭氧氨氧化系統菌群分布相一致。變形菌門與脫氮過程密切相關，在厭氧氨氧化系統中廣泛存在，包括氨氧化細菌(AOB)和亞硝酸鹽氧化菌(NOB)在內的多種微生物都屬于變形菌門，參與脫氮及許多污染物的降解過程。綠彎菌門常在自養脫氮系統中被發現，是起骨架和載體作用的重要伴生功能菌，在ANAMMOX系統中扮演著重要角色。

2.3.2 屬分類水平上菌群結構分析

考察3組反應器在屬水平上的微生物群落結構，并進行分析，不同ANAMMOX反應器中的AnAOB豐度及其在浮霉菌門中的占比見表2.熱圖可以通過可視化的方法直觀地反映微生物的群落組成，污泥樣品中相對豐度排名前25的屬的分布熱圖見圖7.測序結果表明，污泥樣品中典型的ANAMMOX菌屬為CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia，其中， CandidatusJettenia在3組反應器中的相對豐度分別為1.62%、5.74%和5.21%，其在R2反應器中的相對豐度最高，其次是R3反應器，添加填料的兩組反應器中的CandidatusJettenia的相對豐度是空白對照組的3~4倍。 CandidatusBrocadia在3組反應器中的相對豐度均較低，分別為0.57%、1.11%和0.85%。總體來看，R1、R2和R3反應器中的AnAOB在浮霉菌門中的占比分別為57.78%、78.65%和68.40%。可以發現，填料的加入促進了AnAOB在浮霉菌門中占據主導地位，使優勢菌屬更為凸顯。

2.4 厭氧氨氧化生物膜生長和顆粒污泥形成機制

一個良好的ANAMMOX系統中氮的去除往往是以AnAOB為主導功能菌，多種脫氮細菌綜合作用的結果，好氧菌和異養菌為AnAOB提供了基質和生存環境。R2和R3反應器中的ANAMMOX生物膜如圖8所示。

R2和R3反應器中的顆粒污泥主要是通過生物膜分離形成的，可能的顆粒化過程如圖9所示。生物膜的形成是一個動態的過程，包括初始生物量的積累(微生物附著)、發育(生長)和末端生物量的積累(成熟)。最初，懸浮污泥首先吸附在填料上，逐漸生長形成生物膜，這時的生物膜主要由好氧氨氧化菌(AOB)和異養反硝化菌(DEN)組成。待好氧菌把氧氣消耗后，生物膜內部出現缺氧區，為AnAOB的生存提供了有利條件，生物膜上的AnAOB數量逐漸增多。

胞外聚合物(EPS)是形成生物膜的重要條件，李鴻江等的研究發現AnAOB分泌的胞外聚合物含量要高于AOB，故其在填料上的掛膜效果顯著優于AOB。因此，在良好的生存環境下，AnAOB利用氮素實現自身新陳代謝和生長繁殖，菌體數量得以增長，逐漸在填料上形成一層ANAMMOX生物膜并變厚。在機械振蕩和水力剪切作用下，部分厭氧氨氧化聚集體從過厚的生物膜外側分離出來，逐漸形成顆粒污泥，進行菌體的分裂繁殖，實現CandidatusJettenia和CandidatusBrocadia數量的成倍增長，生物膜上的AnAOB的相對豐度是空白對照組的2~4倍。

3、結論

(1)投加填料構建厭氧氨氧化生物膜-顆粒污泥復合系統，可以有效提高室溫下儲存9個月的ANAMMOX污泥的活性恢復速率，投加填料的2組ANAMMOX反應器的AnAOB相對豐度是空白對照組的2~4倍，填料有效提高了反應器中的AnAOB的相對豐度，且彗星纖維填料的促進作用略優于K3填料。

(2)在厭氧氨氧化污泥的活性恢復過程中，填料可以提高ANAMMOX污泥的耐沖擊負荷能力，提高系統的生態穩定性和脫氮穩定性。